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      【客戶文章分享】IF=10.317,Label-free揭秘脫細胞處理能優化視神經的抑制性微環境從而促進神經突生長

      來源: 武漢金開瑞生物工程有限公司   2020-10-26   訪問量:558評論(0)

      本期解讀
      題目:Decellularizationoptimizes the inhibitory microenvironment of the optic nerve tosupport neurite growth
      期刊:Biomaterials
      影響因子:10.317
      研究背景
      細胞外空間中神經元的多種元素組合構成了神經組織的微環境,在神經損傷修復中起關鍵作用。先前已有眾多研究,嘗試通過改變微環境中“促進劑”和“抑制劑”的平衡的方式,以增強損傷后的神經再生。因此,探索調控損傷后神經組織微環境中促進劑和抑制劑平衡的方法具有重要的科學意義。特殊的大腦神經視神經(ON)的視覺通路具有中樞神經微環境。

      先前的研究顯示,ON難以在體內和體外支持軸突再生,研究集中于不同脫細胞組織支架的結構和生物學效應。脫細胞處理的坐骨神經(DSN)、脊髓(DSC)和腦細胞已被用于修復不同的神經組織損傷。由于脫細胞技術是去除包括大多數免疫原和可溶性蛋白的細胞成分的有效方法,因此我們認為脫細胞作用也可以去除ON中的某些抑制性成分,同時保留了一些不溶的促進軸突生長的細胞外基質(ECM)蛋白。

      在這項研究中,作者使用大鼠背根神經節(DRG)培養模型制備了成熟豬的脫細胞性視神經(DON),DSN和DSC,并評估了它們對神經突生長的影響,比較了脫細胞前后ON的蛋白質成分,發現DON優化的神經突促進作用與其蛋白質組成的變化高度相關。證明脫細胞處理后,膠原蛋白IV(COL4)和層粘連蛋白(LAM)的生物活性在DON中能很好的保留。結果表明,脫細胞后促進神經突生長的ECM蛋白的選擇性保留優化了ON的抑制性微環境。

      技術路線


      實驗結果

      1、DON,DSN和DSC中殘留DNA的表征
      同種異體移植物中的核殘基可能在宿主內引起一系列免疫反應,從而導致嚴重的副作用和受損的組織修復。因此,評估脫細胞作用的最重要任務是定量脫細胞材料中的核殘基。
      顯微鏡檢查組織切片顯示天然組織(NT)的無孔結構和脫細胞組織(DT)的多孔結構(圖1A和B),脫細胞處理后組織切片中沒有核染色(圖1B)。在所有DT中,DNA含量均小于50ng / mg(圖1C)。在任何DT的凝膠電泳過程中均未觀察到DNA信號(圖1D)。這些結果表明細胞成分已被有效地從DT中去除。

      圖1 分析DT中的核酸殘基

      2、ON的脫細胞促進神經突向外生長
      為了評估DT對神經突生長的影響,在縱向組織切片上進行了離體背根神經節(DRG)實驗。生長72小時后,將細胞和組織固定,并對神經突進行免疫熒光標記;然后在熒光顯微鏡下確定神經突的最大延伸距離和分支數(圖2A和B)。圖2C顯示了支路的最大延伸距離和數目如何被定義。從結果來看,在DON和DSC上生長的神經突明顯顯示出更長的延伸距離。結果表明,脫細胞作用可以促進DRG神經突在包括ON和SC在內的中樞神經組織上的生長。雖然原始的ON切片不是神經突生長的理想基質,但一些神經突(圖2D中的白色箭頭)仍然能夠沿著神經纖維束區域(圖2D中的白色星號)之間的結締組織隔生長。這表明與神經纖維束區域相比,ON的結締組織隔可能含有支持神經突延伸的某些成分,或缺少某些抑制神經突生長的成分。

      圖2 不同組織基質對DRG神經突生長的影響

      3、DON對神經突取向和神經元附著的影響
      為了進一步驗證DON在神經突延伸方向中的作用,我們在DT(DON,DSN和DSC)和NT(ON,SN和SC)的切片上植入了分離的DRG神經元。孵育72小時后,我們觀察到,與NT切片(圖3A1-3,箭頭)相比,DT切片(圖3A1'-3',箭頭)附著了更多的DRG神經元。我們通過測量NF陽性神經突與組織切片縱軸之間的角度來量化生長取向(圖3B)。DON切片上偏離角度為0°–30°的神經突所占比例大于DSN切片和DSC切片(圖3C)。這表明與其他DTs相比,DON對神經突生長具有更強的定向作用。此外,我們通過計算神經元密度來評估不同組織切片上的細胞粘附性,神經元密度是在0.5mm×0.5 mm區域內被NF和Hoe雙重標記的神經元數量(圖3D)。DON和DSC組的神經元密度顯著高于ON和SC組(圖3E)。DSN和SN組之間的NF陽性細胞數量上沒有顯著差異(圖3E)。

      圖3 DRG神經元的存活和神經突生長

      4、ON的脫細胞主要保留促進神經突生長蛋白
      與NT相比,DT上神經突的不同生長行為可能是由于脫細胞過程引起的蛋白質組成變化所致。因此,對所有三種DT進行了蛋白質組學分析,并比較了DON,成熟視神經(MON)和胚胎視神經(EON)組中每組所有三個重復序列中檢測到的蛋白質成分的變化。從DON,DSN和DSC組中篩選了ECM蛋白,并使用維恩圖(圖4A)可視化了它們的設置關系。脫細胞后,ON丟失了1161個蛋白質(圖4B),其中僅丟失了9種ECM蛋白(圖4B)。這表明ECM蛋白在脫細胞過程中被選擇性保留,而細胞內蛋白被去除。斑點印跡檢測兩種普遍存在的ECM成分(COL4和LAM)進一步證實了這些結果。與MON相比,發現DON和EON中COL4和LAM的濃度均增加(圖4C)。如圖4D所示,脫細胞后觀察到不同ECM蛋白的上調和下調。在標記每個ECM蛋白及其與軸突生長相關的生物學功能后,我們發現大多數(8分之7)生長促進蛋白與軸突延長相關。COL4和LAMB1在ON細胞脫細胞后被保存并富集。相反,大多數(7分之5)的抑制軸突延伸蛋白在脫細胞后水平較低(圖4E)。

      圖4 不同DTs的蛋白質組學分析以及ON和DON組織結果的比較

      5、DON中的COL4和LAM保留生物活性以支持神經突生長
      為了驗證脫細胞后保留的基質蛋白的功能活性,我們選擇COL4和LAM作為測試蛋白,因為它們在促進神經再生方面具有已知的活性。圖5A顯示了對照組中DON切片上DRG神經突生長的狀態。具有不同半徑的紅色虛線表示用于確定交叉點的定量方法(圖5C)。使用了針對COL4或LAM的抗體來阻斷DON中這些蛋白質的功能。隨著抗體濃度的增加,DON中的神經突在長度和密度上降低,COL4或LAM重新引入培養環境可恢復DON中DRG的神經突生長活性(圖5B-D)。這些結果表明,DON中保留的COL4和LAM都在支持神經突生長中發揮作用,且LAM比COL4更能支持神經突生長。

      圖5 COL4和LAM支持DON中神經突的生長

      6、DON中保留的COL4和LAM可以與ITGA1結合
      由于脫細胞涉及物理性震蕩,化學溶解和酶促分解,可能會破壞蛋白質結構,因此尚不清楚DON中保留的ECM蛋白是否可以通過結合其蛋白伴侶發揮功能。整合蛋白在神經元細胞膜上的分布和激活已被證明在成功的軸突再生中發揮重要作用,而COL4/LAM與ITGA1的相互作用被認為可以促進交感神經元的軸突生長。免疫染色顯示,COL4和LAM在DON中明確表達(圖6A)。在將DRG接種三天后,我們觀察到DON切片中神經突沿ITGA1的點狀表達(圖6B)。這些結果證實了ITGA1在介導DRG神經突生長中的重要作用。隨后,我們以ITGA1為誘餌,利用Co-IP技術研究了DON-DRG培養體系中ITGA1與其ECM蛋白(COL4和LAM)的相互作用(圖6C)。我們的結果顯示COL4和LAM都與ITGA1相互作用,如圖6D所示。

      圖6 DON-DRG培養系統中COL4或LAM與ITGA1的相互作用

      小結
      在本研究中,發現脫細胞作用可以優化成熟視神經在支持背根神經節(DRG)神經突定向生長方面的功能。在DON上生長的神經突比在ON上生長的神經突具有更長的延伸距離。與ON相比,DON上的神經突分支也顯著增加。脫細胞作用能選擇性去除了一些軸突抑制分子,例如髓鞘相關糖蛋白和硫酸軟骨素蛋白聚糖,并保留了一些軸突促進的ECM蛋白,包括COL4和LAM。此外,顯示COL4和LAM在DON中被保留,并且它們與整合蛋白ITGA1的結合活性被保留以促進DRG神經突的延伸。總之,這些發現為優化中樞神經組織軸突抑制微環境提供了可行途徑,并為DON支架在中樞神經損傷修復中的應用奠定了理論基礎。



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