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      速率區帶離心法 |你的分離純化方法選對了嗎?

      來源: 貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司   2020-10-26   訪問量:810評論(0)

      密度梯度離心(isodensity centrifugation method)又稱為區帶離心。

      QQ截圖20201026122844.png

      該方法的優點是可以同時使樣品中幾種或全部組分分離,具有良好的分辨率,分離效果好,可一次獲得較純組分。


      缺點是離心時間較長,需制備梯度液,操作要求高。


      按照離心分離原理,密度梯度離心又可分為速率區帶離心法(rate zonal centrifugation method,R-Z)和等密度離心法 (isopycnic centrifugation method)。


      速率區帶離心也可稱為等區密度離心,是根據樣品中不同組分粒子所具有的不同的體積大小和不同的沉降系數將混合樣品進行離心分離提純。


      離心時將需要分離的樣品溶液置于由密度梯度材料(如蔗糖、氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等)形成的梯度液柱上面,樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點的密度,否則無法得到理想的區帶離心效果。離心時,混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區帶,選擇適合的轉速和時間進行離心,當各組分區帶距離拉得遠時,結束離心,然后將區帶取出。這樣只需通過一次離心就可以把混合樣品中的各組分分離提純,其純度和回收率均可滿足要求。


      優點是一次分離純化,組分的沉降系數相差 20% 以上的即可選用此法,分辨力高,操作熟練可以將組分沉降系數相差 5%~10% 的樣品很好的分離。


      缺點是材料的條件限制,樣品液濃度不能太高,否則操作條件很難控制,同時此法與差速離心法相比,處理樣品的量要小的多。



      圖 1 速率區帶離心


      速率區帶離心的時間必須嚴格控制,不能太短,否則樣品區帶不清,時間也不能太長,否則待分離組分可能沉底。需要分離的樣品顆粒的沉降速度取決于顆粒形狀、大小、密度及離心力等因素。離心前后樣品的狀態如圖 1 所示。


      速率區帶離心經典的應用就是通過蔗糖密度梯度離心,進行各種亞細胞器(核糖體、線粒體、Exosome 等)和病毒顆粒(病毒載體、疫苗等)的純化。例如,我們在上一期中得到的 70S 核糖體沉淀,經過水解后,可利用蔗糖密度梯度離心,進一步分離純化得到 50S 和 30S 的兩個亞基。具體的實驗流程如下:


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      * 審批編號:RA-051-cent-adv-ruo

      * 修訂日期:2020/10/16

      * 聲明:未經授權不得做任何修改,貝克曼庫爾特保留在不告知前提下隨時更新版本的權利

       



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